LOWRY METHOD

Deneyin İlkesi LOWRY METHOD

Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptid bağları ile bir kompleks oluşturur ve  Cu+1’ e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys  aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan  rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik  olarak ölçülür.

Uygulama Basamakları

1.Örnek ve standart tüplerine 1 mL protein çözeltisi ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1  mL saf su koyulur.

2.Tüm tüplere 3 mL C reaktifi eklendi. (C reaktifi 100:1 oranında A ve B reaktifi  karışımından oluşturulur. A reaktifi %2 Na2CO3, % NaOH, % 0.16 Na-tartarat; B reaktifi  ise %4 CuSO4.5H2O’dır.)

3.Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir.

4.Tüm tüplere 300 mL Folin-Fenol reaktifi vortekslenerek eklenir.

5.Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir.

6.Absorbanslar 660 nm’de köre karşı okunur.

7.Protein miktarları oluşturulan standart kalibrasyon grafiğinden yararlanarak hesaplanır.

Reaksiyon

Referans: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. 1951 Protein measurement  with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275